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我国对噬菌蛭弧菌的研究
发布时间:2018-04-27 09:02:00 点击次数:793

我国对噬菌蛭弧菌的研究

 

 

中国医学细菌中心弧菌噬菌体研究室  秦生巨

 

    细菌的寄生菌为Stolp 和 Petzold 1962年首次在德国的土壤中于一种植物假单胞菌上发现的。1963年Stolp 和Starr又在美国加利福尼亚州的土壤、污水中用独特的分离技术得到了这类细菌,并命名为Bdellovibrio bacteriovorus(噬菌蛭弧菌,简称蛭弧菌)。因发现这类细菌,Stolp等曾被授予Koch 奖金。由于此类菌对宿主菌的“寄生”和“裂解”的生物特性引起了人们极大的兴趣,20多年来,美国、苏联、日本、以色列、法国、加拿大和印度等许多国家的实验室都在进行对这类菌的研究。蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌。它广泛存在于自然水体、污水及土壤中,也可以从动物或人体内粪便中检出。蛭弧菌可裂解不同科属的多种细菌,如沙门杆菌、不凝集弧菌、副溶血弧菌和一些植物致病菌,如白菜软腐病菌、水稻白叶枯病菌等。蛭弧菌的宿主范围不仅局限于革兰阴性菌,对革兰阳性菌同样有裂解作用。近年来许多研究均已证实蛭弧菌是环境水体自然净化的极为重要的生物因子之一。目前国外许多实验室也在探索利用蛭弧菌净化自然河水、污水中的细菌以及动植物致病菌的清除。1979年我们在国内开展蛭弧菌的研究,1982年我国首次发现并及时报道了蛭弧菌的研究。10多年来对此类菌的培养特性、生态学、生物学、生理学特性及培养物的保存等作了系统的研究。并发现我们分离的蛭弧菌株对许多肠道致病菌,如霍乱弧菌、不凝集弧菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌及大肠杆菌等均有显著的裂解作用。因此我们又着手探索利用蛭弧菌对极易污染肠道致病菌的自然环境水体的生物净化。1985年以来先后进行了在实验条件、模拟自然条件和自然条件河、湖水中对Eltor 霍乱弧菌、不凝集弧菌、大肠杆菌、志贺菌、大肠菌群等净化作用的研究,结果发现蛭弧菌在不同的水体中对许多细菌均有不同程度的清除作用。1983年以后刘秉阳等也相继开展了对此类菌的研究。这些研究为利用蛭弧菌净化自然水体中的霍乱弧菌、伤寒沙门杆菌、不凝集弧菌等肠道致病菌提供了重要的科学依据,而且有极其广泛的应用价值,从而在预防国内常见的肠道传染病方面,在净化自然水体及环境水源保护方面,将产生重大的社会效益和经济效益。

一、蛭弧菌生物学特性的研究

   (一)蛭弧菌的检查、分离

    我们在对蛭弧菌分布调查的基础上分离、纯化了254株蛭弧菌,并对其中一些菌株做了进一步研究。蛭弧菌不能利用环境提供的营养而生长,必须在宿主菌细胞内或其抽提物中才能生长、发育、繁殖,最后使宿主菌裂解。所以,蛭弧菌是一类细胞内的寄生菌。除非菌株发生突变后,可成为腐生或兼性寄生菌,才能利用人工培养基生长。因此在琼脂平板上检查蛭弧菌噬斑,必须用生理盐水洗涤、离心除去携带培养基成分的浓厚的宿主菌(400亿/ml以上)悬液制备琼脂平板。由于琼脂平板中几乎没有可供生长的营养,所以宿主菌在此平板上几乎不生长,或生长相当缓慢,而且浓厚的菌体使琼脂平板成为半透明状态。蛭弧菌接种在此琼脂平板中,感染了宿主菌,在其生长增殖并使其裂解,再感染周围的宿主菌使其裂解,如此逐渐扩大,就形成了一个无菌的透明区,称为蛭弧菌噬菌斑。

   (二)蛭弧菌培养基的选择

    蛭弧菌在灭菌自来水、灭菌海水、灭菌蒸馏水、酵母膏-胨液(YP)、酵母膏-胰胨液(LB),Tris无机盐缓冲液及1/10、1/5胨-肉膏液制成的琼脂平板上均可形成噬菌斑。作者采用灭菌自来水制备琼脂平板;在液体中培养蛭弧菌也采用灭菌自来水,蛭弧菌发育良好,操作也极为方便,并可节省大量的人力、物力和财力,比较了双层琼脂、双层琼脂夹心、单层琼脂和琼脂平板表面法检查蛭弧菌噬斑。双层琼脂平板噬斑发育良好,分布均匀,不易干燥,适当封闭后标本还可以长期保存,操作也很简便易行,为我国蛭弧菌研究工作中首先选用的方法。

   (三)蛭弧菌的培养特性

    蛭弧菌的噬斑透明,无菌落形成。蛭弧菌的不同菌株其噬菌斑的形态、大小也不同,大的直径可超过15 mm ,小的直径只约0.5  mm(48h),而且可随培养时间的延长而扩展。用双层琼脂平板培养得到的蛭弧菌噬斑与噬菌体噬菌斑极为相似,但以同样的培养基(自来水)和方法(洗涤的菌悬液为宿主)检查噬菌体不能见到的噬菌斑。我们曾试以El Tor霍乱弧菌噬菌体、福氏志贺噬菌体、大肠杆菌体及绿脓杆菌噬菌体检查,均不能检出噬菌斑。用检查噬菌体的方法及培养基检查蛭弧菌同样不能见到噬菌斑。蛭弧菌及噬菌体均培养于4 ℃ 环境中,分离的大多数蛭弧菌仍可出现噬菌斑,但噬菌体虽于胨-肉膏营养琼脂上也不会出现噬菌斑。

    在液体中培养、增殖蛭弧菌,蛭弧菌能侵染、裂解宿主菌,3-5d使浓厚的宿主菌悬液裂解、澄清,蛭弧菌的数目增加。但是用这种方法增殖蛭弧菌,很难得到高效价的蛭弧菌培养物,即使在澄清的蛭弧菌培养液中反复的补充宿主菌,也不能达到高效价的增殖蛭弧菌的目的,原因尚不清楚,有待进一步研究。

   (四)蛭弧菌的形态结构

    蛭弧菌噬菌斑革兰染色高倍镜观察,可见典型的、多量的革兰阳性、小的弧或杆状细胞。蛭弧菌噬菌斑悬滴相差显微镜下可见到运动极其活泼,呈跳跃式积极追捕宿主的蛭弧菌细胞,在相差显微镜下可以连续观察蛭弧菌吸附、侵染,进入、增殖、生长、裂解宿主细胞的全过程。

电子显微镜负染透射镜观察,可见到弧状或杆状蛭弧菌细胞,细胞一端有一长的单鞭毛(图1)。还可见到蛭弧菌吸附在宿主菌细胞上的典型形态(图2)。

                

  图1 蛭弧菌的端生鞭毛                  图2 蛭弧菌吸附于宿主菌的情况

     噬菌蛭弧菌Bd39电镜照片(×24920)          下端为宿主福氏志贺菌,上端为Bd76(×19780)

我们观察了12株蛭弧菌的形态,结果发现不同蛭弧菌的细胞大小有所差别,同株的细胞大小也有差异。蛭弧菌细胞的大小,一般为长0.8~1.4μm,宽0.3~0.5μm之间。超薄切片电镜观察,可见到蛭弧菌在细胞内生长、繁殖的结构(图3)。

图3蛭弧菌与宿主菌的相互作用

    (五)pH对蛭弧菌噬菌斑形成的影响

    我们观察了于不同pH自来水宿主双层琼脂平板上检查蛭弧菌(Bd81,Bd98)形成噬菌斑的能力,结果表明pH对蛭弧菌生长及噬菌斑形成有明显的影响,虽然pH在3.0~9.8的自来水宿主菌双层琼脂平板上均可形成噬菌斑,而pH7.0~7.6最为适宜。pH在5.5或以下,pH9.0或以上,噬菌斑数目约减少一半.但蛭弧菌的生物特性不发生改变。

    呼兰等从人粪便分离获得的蛭弧菌BdC、BdE、BdL、BdW最适pH为7.0,pH9.0不能形成噬菌斑,其原因有待进一步检查。

    (六)温度对蛭弧菌的影响

      1.温度对蛭弧菌噬菌斑形成的影响

    不同蛭弧菌株形成噬菌斑的最适宜温度并不完全相同。我们观察了来自海水、海泥、河水、河泥、湖水、污水和人粪便中分离得到的262株蛭弧菌在4,10,15,20,25,30,37℃环境中形成噬菌斑的能力,发现20-30℃时对大多数菌株的噬菌斑形成更为适宜。少数菌株(Bd59)37℃更为适宜。人粪便中分离的蛭弧菌也是以37℃最为适宜。在4℃冰箱中也能形成噬菌斑,但需较长时间(如12D以上)。近来研究发现,极少数菌株可诱导至43℃中生长。为利用蛭弧菌制剂预防动物肠道细菌病提供了依据。

    2.温度对蛭弧菌生长增殖的影响

    秦生巨等报道,在灭菌自来水中加入适当比例的蛭弧菌和宿主福氏志贺菌,分别于4,10,15,20,25,30和37℃及室温(7℃±2℃)水浴中培养,每隔24h取样一次,以自来水宿主双层琼脂平板法检查蛭弧菌生长繁殖的数目。从自来水宿主双层琼脂平板中蛭弧菌形成噬菌斑数目来看,蛭弧菌生长繁殖的最为适宜温度为25℃,温度较高,如37℃时蛭弧菌数目反而逐渐减少,并失去活力。但于4℃冰箱中可继续生存,培养至第4天增殖数量为最高,此后反而减少,原因有待进一步研究,或可能因为宿主减少,蛭弧菌没有赖以繁殖的宿主。

     3.温度对蛭弧菌活力的影响

    研究中发现蛭弧菌培养物不耐热,如蛭弧菌Bd81、Bd98,15~25℃以上时乃呈渐渐失活的现象,如以25℃时,蛭弧菌的活存数目为100%,则15~20℃时呈较为稳定状态,存活数分别为94.9%~100%(Bd81);30,35,40,45及50℃是时存活率依次为78.0%,62.7%,40.7%,30.5%和0%。

     4.温度对蛭弧菌净化河水的影响

    蛭弧菌在污水自净过程中参与作用的研究结果证明,蛭弧菌裂解作用可降低污水中异养性革兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量。这种裂解活性明显地受温度影响,因为温度可影响寄生菌与宿主菌之间相互作用的速度,在水温为26℃时寄生物/宿主(P/H)的指数最大,而在19℃时最小。当污水在26℃净化时,沉淀池污水中含大肠杆菌为800CFU/ml,而在19℃净化水时含大肠杆菌为4000 CFU/ml,污水中相互作用的微生物数量发生变化,这是典型的P/H的关系。这些研究结果证明,在污水自净过程中,蛭弧菌在26℃环境河水中可以有效地参与清除肠道微生物群,而在23.5℃时清除率低,在19℃环境河水中蛭弧菌不能实现对其污水净化作用。另据报道,蛭弧菌Bd81和Bd98在25℃的湖水中对宿主福氏志贺菌有显著的清除作用,如7d时,福氏志贺菌可被清除92.8%(Bd81)和94.4%(Bd98)。不加蛭弧菌的对照仅减少20%,统计学有非常显著性差异(P<0.01)。

   (七)蛭弧菌在死的宿主菌中的生长特性

    蛭弧菌Bd81、Bd98于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上可比在未经处理的活的宿主菌双层琼脂平板上更迅速的形成噬菌斑,后者一般需40~48h才可出现噬菌斑。在加热及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h,形成噬菌斑的数目也大大增多。例如在100℃加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍,Bd98增加约72倍,在80℃加热致死的宿主菌中Bd81增加151倍,Bd98增加73。氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍,Bd98增加67倍。在这些宿主菌的琼脂平板中形成的噬菌斑也明显的小于在活菌平板上,形成噬菌斑的时间也较快(Bd81为28h,Bd98为 36h),数量也有增加(Bd98)或没有增加。在抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄青霉素及多粘菌素B)处理失活的宿主菌双层琼脂平板上,形成噬菌斑的时间差别不大,噬斑的数量与在活菌宿主菌双层琼脂上也不增加(Bd81)或差别不大(Bd98)。

    检查了Bd81、Bd98于100℃热死宿主菌自来水培养液中生长增殖的情况。分别在活的及加热致死的宿主菌双层琼脂平板上计数噬菌斑,用活的宿主菌双层琼脂平板检查,试验组第2天(48h)蛭弧菌Bd81噬斑增加到1.1×104PFU/ml ,对照组增加至8.4×103 PFU/ml ,第五天两组均达到最高,试验组为1.1×105PFU/ml,对照组为6.0×104 PFU/ml,试验组为对照组的183.7%。同样,Bd98在48h试验组噬菌斑增加至6.3×104PFU/ml,对照组为6.7×103PFU/ml,第五天试验组增至9.0×104PFU/m,对照组为4.9×104PFU/ml,前者为后者的183.7%。如培养后蛭弧菌以加热致死的宿主菌双层琼脂平板计数噬菌斑,培养48h后,试验组Bd81为3.4×106PFU/ml,对照组为4.0×105PFU/ml ,第五天试验组为8.0×106PFU/ml,对照组为8.0×105PFU/ml,前者为后者的10倍。 Bd98试验组48h后噬菌斑为2.1×107PFU/ml,对照组为8.0×104PFU/ml,第五天试验组为2.4×107PFU/ml,对照组为2.3×105PFU/ml,前者为后者的10.4倍。

    实验结果证明,在加热致死的宿主菌上生长增殖的蛭弧菌,再接种在活的宿主菌琼脂平板上仍然恢复其生长特性和裂解的活力。

二、蛭弧菌噬菌特性的研究

   (一)蛭弧菌对不同科属细菌的宿主范围

    从8株蛭弧菌在不同科属24株菌的琼脂平板上形成噬菌斑的能力试验中,发现蛭弧菌的宿主范围均较广,都可在自来水宿主双层平板中裂解较多不同科属的革兰阴性菌株及部分阳性菌株,于48h产生噬菌斑(表1),从宿主范围看,不同的蛭弧菌株对宿主的选择并不相同。

表1  8株蛭弧菌在不同宿主上形成噬菌斑的活力

宿主菌株

             蛭弧菌形成噬菌斑的能力

Bd39    Bd40      Bd59    Bd76    Bd81     Bd94   Bd98   Bd128

霍乱弧菌古典型569B    +〕     +       +       +         +      +      +         -

霍乱弧菌E1Torl18001   +         -       +       +         +      +      +    ⊕ 〔+〕

霍乱弧菌E1Torl18003   +         -         +       +       (+)    +        +     〔+〕

霍乱弧菌E1TorE97      +         -         +       +         +      +      +         +

不凝集弧菌17007       -         -         +       +         +      +      +         -

副溶血弧菌20004       +         +         +       +         +      +      +         -

福氏志贺菌51573       +         +       +       +         +      +      +         +

福氏志贺菌Fl71-1      +       (+)     +       +         +      +      +         +

宋内氏志贺菌51592     +       +         +       +         +      +      +     〔+〕

鲍氏志贺菌51582       +         +       +         +     (+)    +      +         +

伤寒沙门菌50097       +         +         -       +         +      +      +         +

伤寒沙门菌901         +         -         +       +         +      +      +         +

副伤寒甲沙门菌50001   +       +     (+)       +         +      +      +         +

副伤寒乙沙门菌50005   +       +         +       +         +      +      +         +

肠炎伤寒沙门菌50013   +       -         +       +         +      +      +         +

鼠伤寒沙门菌50013     +       +       +         +         +      +        +       +

猪霍乱沙门菌50019     +       +         +       +         +      +      +         +

大肠杆菌44813         +       +         +       +         +      +      +       〔+〕

大肠杆菌44817         +         +         -       +         +      +      +         +

变形杆菌49027         +         +         -       +         +      +      +         +

铜绿假单胞菌10102     +       +         -       +         -      +        +       +

金黄色葡萄球菌26003   -       +       (+)     +         +      -      +         -

粪链球菌32221         +         -         -       -         +      -      +         -

枯草杆菌67510         -         -         -       -         -      -      -         -

        注:表内“+”为在30℃培养48h阳性结果;“〔+〕⊕”为72h结果,“—”为48h结果;(+)为先培养48h进行测试然后再以较浓蛭弧菌复试结果(Bd40量为104PFU/ml,Bd59、Bd81为103PFU/ml)

   (二)蛭弧菌对弧菌的裂解作用

    蛭弧菌对弧菌具有较广泛的裂解范围,包括古典型霍乱弧菌,EL Tor霍乱弧菌及不凝集弧菌的大部分菌株均可被裂解。在以Bd81、Bd98两株蛭弧菌对69株弧菌的裂解试验中,其中Bd81裂解56株,占81.2%;Bd98裂解54株,占78.5%。Bd81、Bd98蛭弧菌对57株EL Tor生物型霍乱弧菌的裂解没有噬菌体型特异性选择。对高氏法噬菌体分型的1,2,3,4,5和6型菌株,非溶非复菌株及其他抗性菌株均有被裂解。

    蛭弧菌Bd81、Bd98对59株霍乱弧菌的裂解同样没有血清学型特异性选择。对血清学分型的稻叶、小川型的裂解率Bd81为74.2%或89.3%。Bd98为77.4%或82.1%。

   (三)蛭弧菌对伤寒沙门菌的裂解作用

    蛭弧菌Bd81,Bd98对206株(江苏省地方菌201株,标准菌5株)伤寒沙门菌有显著的裂解作用,在自来水双层琼脂平板上,大多数可以形成清晰透明的噬菌斑,裂解强度不完全一致。Bd81裂解率为96.6%,Bd98裂解率为99.02%。

    研究结果还表明蛭弧菌对不同噬菌体型别的伤寒沙门菌的裂解,没有噬菌体型特异性的选择。对分型A、D1、D2、E1、E9、K1、M1、36,53和96型菌株,均有菌株被裂解。

    蛭弧菌对抗20种不同抗生素的184株伤寒沙门菌同样有较好的裂解作用,经统计学处理,P>0.05,无显著差异。

    河水中分离的伤寒沙门菌也可被裂解。

   (四)蛭弧菌对动、植物致病菌的裂解作用

    司穉东等报道,蛭弧菌不但对人类病原菌有裂解作用,而且对许多植物病原菌也有较强的噬菌能力。如从上海近郊河水中分离的蛭弧菌对大豆疫病假单胞菌,白菜软腐菌和水稻白叶枯病黄单胞菌等均有较突出的裂解功能。

    蛭弧菌以水生致病菌也有裂解作用。如Bd81、Bd98、Bd112、Bd32、Bd127、Bd83、Bd64、Bd296对江苏无锡太湖地区养育珍珠的河蚌中分离的9株嗜水气单胞菌的裂解率可高达90%以上。如能利用这一现象,将可产生良好的经济效益。

   (五)蛭弧菌对动物角(结)膜的保护作用

    实验亦已证实,以10亿个菌的剂量对小鼠、豚鼠、家兔等不存在毒力和毒性作用。就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。有人指出,蛭弧菌外用有预防部分动物角膜炎的效果。呼兰、刘秉阳用福氏志贺菌感染豚鼠角结膜,并同时滴加蛭弧菌107PFU。结果发现15只感染的豚鼠眼中有6只未发病,得到保护,其保护率为40%。另外部分未获得保护的豚鼠眼是否由于福氏志贺菌感染用量较大或其他原因,有待进一步探索。

三、蛭弧菌培养物保藏方法的研究

   (一)蛭弧菌在灭菌自来水中的存活时间

    蛭弧菌于灭菌自来水中的存活时间受温度的影响,4℃环境中保存,大部分蛭弧菌存活8个月以上,极少数菌株仅存活2个月。在自来水保存液中定时添加宿主菌,保持一定浓度,并不能使蛭弧菌不断增殖而延长时间。在灭菌自来水中保存的蛭弧菌保存时间的延长而逐渐减少,如Bd81 4℃保存6个月,菌数由1.17×107PFU/ml减少到250 PFU/ml,4个月则有些菌株的活菌数减少到几个或0。

   (二)蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中的存活时间

    我们检查了12株蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中,于4℃环境中存活时间。发现91d蛭弧菌的存活菌株占100%,157d或188d占91.7%,240d占67.7%,31d占58.3%,372d占50.0%,411D占25.0%,548d占16.7%,600时全部检不出蛭弧菌。从保存的自来水宿主软琼脂外观看,发现有部分蛭弧菌有液化现象。如Bd83保存60 d以上可见轻度液化,保存时间越长,液化的现象更为显著,但与蛭弧菌的存活时间无明显关系。引起液化的原因不晴楚,有待进一步探讨。

   (三)蛭弧菌培养物的冻干保存

    用脱脂牛奶作保护剂冷冻干燥于4℃冰箱保存11株蛭弧菌培养物,两年的存活率为100%,3年的存活率为81.8%。随着蛭弧菌保存时间的延长,其活菌数目显著减少,如以3年为例,有18.2%的菌株检不出活菌,72.8%的菌株数目也减到几个(1~8PFU),一般为原活菌的0.02%~2.0%。

    以上3种方法保存的蛭弧菌次代培养物的生物学特性和寄生、裂解宿主菌的能力均不发生改变。如25℃培养48h即可形成透明噬菌斑,噬菌斑的形态、大小、特征均与原菌株相似,无明显改变。

四、蛭弧菌生态学的研究

    (一)蛭弧菌在动物体内的分布

    现已证明,蛭弧菌在马、牛、猪和鸭等动物肠道中都可检出,并经常随粪便排出体外到外环境中,其蛭弧菌的含量较低,一般在1~200 PFU/ml。同一研究,在人体、小鼠、蚌和鱼体内的粪便中没有检出蛭弧菌,这可能与检索的样本数较少有关。

    (二)蛭弧菌在人粪便中的分布

    近年来,呼兰和刘秉阳成功地用自来水双层琼脂平板从86份人体粪便标本中获得8株人粪便蛭弧菌,其标本均来自儿童和青年。从检查结果来看,其检出率显著低于污水等检出率,且蛭弧菌的含量也较低,一般为10~90 PFU/g,形成蛭弧菌斑的时间需5~10d。在此前有人试图从人粪便中分离蛭弧菌,共检查了279份人粪便标本,未得到阳性结果。

    从人粪便中分离获得的蛭弧菌,其生长特性,如温度、pH等与环境中分离获得的蛭弧菌不完全一样,但它们都有寄生性。

    (三)蛭弧菌在自然水(或土壤)中的分布及数量调查

    我们自1979年以来先后7次在江苏、山东、北京和安徽等31个市、县258处共采水(泥)样325份,以El Tor霍乱弧菌、福氏志贺菌、副溶血弧菌,大肠杆菌为宿主菌进行检查,在任一宿主菌上出现噬菌斑者为阳性结果,共检出阳性254份(78.15%)。如样品中加宿主菌培养增殖后再以自来水宿主双层平板检查,则阳性率均有明显提高。

    蛭弧菌在这些样品中的含量为1~5880 PFU/ml或g(泥)。海泥的含量为2~246 PFU/ g ;湖水中含量为2~268PFU/ml;河水(包括塘水、污水)中含量为1~5880 PFU/ml。

    张贤良等调查了江苏南通地区7个县、市的河水、井水、自来水、塘水等156份样品中蛭弧菌的含量,其中阳性79份。检出率以浅井水为最高,占60.61%,依次为塘水、河水、自来水、深井水,蛭弧菌的含量为2~46 PFU/ml。

    赵广钤等调查了蛭弧菌在各类井水中的分布,其结果被调查的21处井水,有19处检出蛭弧菌,即使在含有0.6PPm余氯的井水中,也可检出蛭弧菌。7处河水全部检出蛭弧菌。遗憾的是没有做定量分析。

    (四)蛭弧菌不同季节在自然水域中的分布及其变化

蛭弧菌在自然界中分布非常广泛,一般说来,凡有细菌存在的地方都有它们的存在,特别是污水环境中它们的分布较为普通。但是蛭弧菌在环境中的分布及其变化与季节和河水污染程度有关。夏季较多,冬季、春季分别为夏季的16.6%和44.8%。秦生巨1983~1984年间以南京市5处终年不涸的湖、河水中蛭弧菌含量的调查结果表明,5处水体中蛭弧菌含量最低为11 PFU/ml,最高为4990 PFU/ml,全年均可检出(表2)。以7~9月含量较高,以后逐渐减少,到次年5~6月又逐渐增多。蛭弧菌的含量与气温有很相一致的升降关系户。气温较高季节,水中可供为蛭弧菌生长增殖的宿主菌也随之增多,这可能是原因之一。

(五)蛭弧菌噬菌体

    蛭弧菌可使一些细菌遭到毁灭性的溶解,可是蛭弧菌本身也受另一类生物的威胁,那就是蛭弧菌噬菌体(bdellophage)。它们对寄生性和非寄生性的蛭弧菌都有裂解作用。然而,蛭弧菌噬菌体具有严格的专一性,并有其影响蛭弧菌裂解过程的作用。当蛭弧菌直接吸附宿主菌之前,或在完全侵入宿主周质之前,蛭弧菌噬菌体尾部首先吸附在蛭弧菌细胞上,然后,该噬菌体的核酸注入到蛭弧菌中,便完成它对宿主细菌的侵入,头部完全以空壳保留在细胞外,感染特异性噬菌体的蛭弧菌仍保持其原来的状态和大小,蛭弧菌噬菌体在蛭弧菌细胞中生长繁殖,而蛭弧菌本身仍处于宿主菌细胞中,结果导致蛭弧菌的宿主细胞破裂,此时,蛭弧菌噬菌体被释放到体外。

                表 2  不同季节蛭弧菌于外环境地面水体中的数量              

                 各       月       份                                            

地点      1    2    3      4     5     6     7     8     9    10     11    12    

玄武湖   12    16    36     44     134    114    230    240    未检   120     54     未检

        (5.0)(6.7)(15.0)(18.3)(67.0)(47.5)(95.8)(100.0)     (50.0) (22.5)

莫愁湖   90    78    138    136    144    197    124    268     240    42     20      11

      (33.6)(29.1)(51.3)(50.8)(53.7)(36.2)(46.3)(100.0)(89.6)(15.7)(7.5)(4.1)

秦淮河   52    132   117    148    214    458    579   1300    1400   728     170     25

      (4.0)(10.2)(9.0)(11.4)(16.5)(35.2)(44.5)(100.0)(107.7)(56.0)(13.1)(1.4)

山西路   170    310   436    436    652    972   1900   1700    1400   164     150    120

串城河(10.0)(18.2)(25.7)(25.7)(38.4)(57.2)(111.8)(100.0)(82.4)(9.7) (8.8) (7.1)

太平路   68    140    138   338    1300  1600    4600   4600    4900  980      200    64

串城河 (1.5)  ((3.0) (3.0))(4.9)) ((7.4))(28.3))(34.8)) (100.0) (106.5)(21.3)  (4.4)  (3.4)           

 

注:表中所列数字为蛭弧菌PFU/ml,括号中的数字为阳性率

  

五、蛭弧菌以水中细菌净化作用的研究

    蛭弧菌能寄生和裂解细菌,可否利用这一特殊的生物特性作为以菌制菌的手段?在实验室条件下,在灭菌自来水和灭菌湖水中证实对El Tor霍乱弧菌和福氏志贺菌的清除作用。在模拟自然条件的河水中蛭弧菌对El Tor霍乱弧菌同样有净化作用。为了进一步探索在自然条件下对细菌的净化作用,我们于自然环境河水中进行了蛭弧菌对不凝集弧菌净化作用的探索,结果也证实蛭弧菌对不凝集弧菌、细菌总数、大肠菌群均有显著的净化作用。

   (一)蛭弧菌在灭菌湖水中对宿主菌的净化作用

    蛭弧菌Bd81、Bd98在pH7.4~7.6的灭菌湖水中,对宿主福氏志贺菌有显著的清除作用,数日内可使含有2.3×108CFU/ml浓厚的菌悬液变为澄清透明。如7 d时福氏志贺菌被清除92.8%(Bd81),或97.4%(Bd98)。而不加蛭弧菌的对照仅减少20%。

    不同数量(60,458,1200,1900和7000PFU/ml)蛭弧菌Bd81于灭菌湖水中25℃时对浓度为5.0 ×106~8.0×106CFU/ml El Tor霍乱弧菌均有净化作用,且随着蛭弧菌与El Tor霍乱弧菌投入比的增加,El Tor霍乱弧菌被清除的速率也增快,以5.0 ×106~8.0×106CFU/ml El Tor霍乱弧菌清除到活菌计数为0时,投入比约为1:100000时需24d,约为1:10000时需18d。

    蛭弧菌于灭菌湖水中25℃时对浓度为2.3 ×107~3.6×107CFU/ml大肠杆菌悬液亦有除菌效果。如第21天,加有蛭弧菌湖水中的大肠杆菌由原来的3.5×107CFU/ml,减少到11 CFU/ml。而不加蛭弧菌对照组湖水中的大肠杆菌由原来的2.3×107CFU/ml减少到3.2×103CFU/ml。统计学有非常显著性意义(P<0.01)。

    (二)蛭弧菌地模拟自然条件河水中对细菌的净化作用

    司穉东等报道,江苏如皋县境内的模拟自然条件的河水中蛭弧菌Bd81可使河水2d后变为澄清透明,6d后加有蛭弧菌和El Tor霍乱弧菌试验组的河水也变为澄清透明,但只加蛭弧菌的河水清澈。而只加有El Tor霍乱弧菌对照河水,第13天试验结束时,肉眼仍可见混浊状态。El Tor霍乱弧菌计数结果发现,9d后试验组每毫升菌落形成单位由5.78×107减少到20。相同时间内,El Tor霍乱弧菌对照组每毫升菌落形成单位由2.50×107减产到3.71×103

    赵广钤等在模拟自然条件的河水中也观察到了蛭弧菌对El Tor霍乱弧菌有净化作用的结果。如21d时,试验组的El Tor霍乱弧菌每毫升菌落形成单位由2.4×106减少到0。对照组仍为80 CFU/ml。

    蛭弧菌Bd81在模拟自然条件的河水中对细菌总数也有显著的影响,9d时,可使细菌总数由原来的5.97×107CFU/ml减少到1.93×103CFU/ml,对照组则由原来的5.60×107CFU/ml减少到4.13×104CFU/ml,11d及13d时,试验组河水中细菌总数均低于相应的对照组。

    实验证实,蛭弧菌对模拟自然条件河水中革兰阴性菌的裂解率显著高于阳性菌的裂解率。因此蛭弧菌作用于河水中的细菌时,可以使河水中阴性菌迅速减少,减少的数目也多,阳性菌也有减少,但不及阴性菌,如11d及13d时,加蛭弧菌的试验组,河水中的阴性菌由原来的98%减少到64%及56%,而不加蛭弧菌对照组河水中的革兰阴性菌由原来的96%减少到94%及78%。

    蛭弧菌在模拟自然条件的河水中,不但对El Tor霍乱弧菌、细菌总数有净化作用,而且对大肠菌群也特别明显,如加蛭弧菌的模拟自然条件的河水中的大肠菌群,由原来的2.38×106/L减少到2.30×103/L不加(减少99.9%),不加蛭弧菌对照组模拟自然条件河水中的大肠菌群仅由2.38×106/L减少到2.38×105/L。

    赵广钤报道,蛭弧菌在模拟自然条件的河水中对大肠杆菌K12有清除作用。14d时加有蛭弧菌河水中的大肠杆菌K12每毫升菌落形成单位由原来的3.7×106减少到0,对照组为30。

    在进行蛭弧菌对模拟自然条件河水中El Tor霍乱弧菌、大肠杆菌、细菌总数等净化作用的同时,也观察了蛭弧菌本身的生长繁殖活动,并且河水中不需人工加入宿主菌,也可利用水体中存在的细菌长期繁衍生存。如以试验9d为例,同时加有蛭弧菌和El Tor霍乱弧菌的模拟自然条件河水中的蛭弧菌数目可由原来的100%(1.40×103PFU/ml)增加到9642.8%(9.0×104PFU/ml),而仅加蛭弧菌对照河水中的蛭弧菌数目也由原来的100%(2.60×103PFU/ml)增加到423.08%(1.1×104PFU/ml)。前者增长的倍数高于后者。

   (三)蛭弧菌在自然环境河水中对细菌的净化作用

    我们在江苏省盐城市境内的自然环境河水中观察了蛭弧菌Bd81对不凝集弧菌17040-1等的净化作用。自然河水的选择:河流东西走向,河堤上有芦苇、杂草等。河水肉眼观察稍有浑浊,河水中有水草等水生物分布,并有鱼、虾、蚌、蛙、蟾蜍、蛇等水生动物存在。河水自然pH(7.1~7.8)。河水中没有检出不凝集弧菌17040-1的噬菌体。不凝集弧菌17040-1活菌计数结果,21d时,不凝集弧菌17040-1加蛭弧菌Bd81试验组河水中的不凝集弧菌每毫升菌落形成单位由原来的6.8×106减少到27,相同时间内,不凝集弧菌 17040-1对照组河水中的不凝集弧菌仅由原来每毫升菌落形成单位4.46×106相应减少到1.88×103。于30d时,试验组河水中的不凝集弧菌检不出活菌,而对照组持续到48d时才检不出不凝集弧菌。统计学有非常显著性差异(P<0.01)。

    在同一自然水体中,蛭弧菌Bd81对河水中的大肠菌群有同样的净化效果,如21d时,加有蛭弧菌的河水中大肠菌群由原来的2.38×106/L减少到2.38×103/L。相同时间,对照组河水中大肠菌群由原来的2.38×106/L仅减少到2.38×104/L。大肠菌群的数量对照组高于试验组100倍。试验结果时,试验组河水中大肠菌群仅为960CFU/L,而对照组河水中仍含有2.38×104 CFU/L。这一结果,一方面为利用蛭弧菌净化自然河水进一步提供了依据;另一方面对利用蛭弧菌作为水质卫生细菌学指标,也具有较大的实际意义和理论价值。

    何为等在研究中发现,自然河水中蛭弧菌的检出量与大肠菌群的含量有一定平行升降关系。如大肠菌群为2300 CFU/L时,蛭弧菌检出机会少;大肠菌群大于23800 CFU/L时,检出机率升高。

    蛭弧菌在污水中对浮游球衣菌、伤寒沙门菌、鲍氏志贺菌、大肠埃希菌等多种细菌都有清除作用。在自然河水中,蛭弧菌Bd81在清除不凝集弧菌和大肠菌群的同时,对细菌总数也有显著的影响。如30d时,加有蛭弧菌河水中的细菌总数由初始的5.28×105CFU/ml减少到450CFU/ml,不加蛭弧菌河水中的细菌总数由初始的9.80×105CFU/ml仅减少到4.60×103CFU/ml。两者相比,后者高于前者55倍,统计学处理结果,试验组和对照组有非常显著的差异。据结果推测,蛭弧菌将使河水中多种细菌生命活动遭到破坏,从而减少环境水体致病菌的污染,改善水源,保护人群健康具有积极的理论意义和应用前景,对肠道传染病的防治有较大的指导意义和理论价值。

    何为报道,河水中细菌总数低于1000 CFU/ml时,蛭弧菌检出率极低,细菌总数达104~106 CFU/ml,蛭弧菌检出率高。

    蛭弧菌对革兰阴性菌的裂解效果显著优于对阳性菌的裂解效果。如我们检查了蛭弧菌Bd81对自然河水中分离的24株革兰阴性菌的裂解率为98.53%;26株阳性菌的裂解率为46.15%。

    进一步观察发现,蛭弧菌Bd81在清除自然河水中细菌时,使河水中的革兰阴性菌数目迅速减少。革兰阳性菌由于极少数菌株被蛭弧菌Bd81裂解,数目也有减少,但不及革兰阴性菌显著,为此自然河水中的革兰阴性菌的比例发生了显著的变化。如33d时,加蛭弧菌Bd81的试验组河水中阴性菌由原来的97.50%减少到44.0%,而不加蛭弧菌对照组河水中革兰阴性菌仅由原来的97.06%减少到72.0%。

    蛭弧菌在试管中可以裂解浓厚的宿主菌,在这期间蛭弧菌本身得到了相应的生长繁殖。进一步研究发现,蛭弧菌在模拟自然河水中在裂解利用河水中的El Tor霍乱弧菌、大肠菌群、细菌总数时,一方面清除了河水中的这些细菌,另一方面蛭弧菌也利用这些细菌为宿主菌,进行自己的生命代谢活动,从而得到了繁衍生存。我们在探索蛭弧菌对自然河水中不凝集弧菌等净化作用时,又进一步证实,蛭弧菌在自然河水中能清除不凝集弧菌、大肠菌群、细菌总数等,同时蛭弧菌也同样能生长繁殖。如12d时,加有蛭弧菌的河水中蛭弧菌可由原来的4.40×103PFU/ml增长到1.66×104PFU/ml,或由原来的2.60×103PFU/ml增长到2.0×104PFU/ml。这些研究结果,均已证明蛭弧菌在自然河水中只要有宿主菌存在,蛭弧菌就可以长期繁衍生存。

   (四)蛭弧菌与宿主菌数目的比例对水体中宿主菌清除作用的影响

    蛭弧菌可以净化水体中的细菌,这是无疑的,但蛭弧菌在净化细菌时,受多方面因素的影响,如温度、pH、生物等,其中蛭弧菌的量和蛭弧菌与宿主细菌的比例也是众多的影响因素之一。有人认为,蛭弧菌要发挥净化河水中细菌的功能,其在河水中的含量必须要达到102~103 PFU/ml,否则,效果极差甚至达不到净化的目的。蛭弧菌与宿主菌的比例以1:1000较为合适。我们也得到了类似的研究结果,如蛭弧菌于25℃环境水体中蛭弧菌与大肠杆菌比例为1:78,1:514,1:40600,1:337000,1:4040最为适宜。比例过高或过低蛭弧菌和宿主菌的消长很不明显。

    (五)蛭弧菌在对自然河水净化过中河水中理化指标的变化

    我们在进行观察蛭弧菌对自然河水中不凝集弧菌等细菌净化作用的同时,还观察了自然河水中理化指标的变化。实验开始时,由于每毫升河水中投入的细菌在1000万个以上,肉眼观察河水呈浑浊状态。到第5天时,加蛭弧菌的试验组河水有澄清趋势,到48d实验结束时,加蛭弧菌的自然河水都显著澄清透明,而加不凝集弧菌对照组河水仍呈浑浊状态。进一步检查河水的浊度单位,加蛭弧菌河水中的浊度单位也逐渐降低,如实验结束时,加有蛭弧菌河水的浊度由原来的40下降到10,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的浊度单位由原来的40下降到25。加蛭弧菌的河水生物耗氧量随着自然河水的逐渐净化而降低,如加蛭弧菌的试验组河水的生物耗氧量开始为7.6mg/L,到实验终末时减少到3.4mg/L,相同时间内,不加蛭弧菌对照组河水的生物耗氧量由原来的7.5mg/L仅降低到5.7mg/L。在整个试验过程中,pH、氧化物、总硬度、钙、镁的含量都发生了一系列改变。推测这一系列理化指标的改变与蛭弧菌净化宿主菌的活动有密切关系,但这些变化是否为蛭弧菌净化河水的规律或客观指标,还有待进一步的研究。

六、蛭弧菌研究的理论意义及应用价值

1982年我们在国内首次发现并及时报道了蛭弧菌,对此类菌在我国某些水体中的分布、含量以及不同季节中数量的变动进行了调查。发现此类菌在水体中分布很广泛,河、湖、塘、污水及海水中均可分离到,而且在自然河水中的含量与水体被污染的程度呈高度正相关,但在洁净的矿泉水、深井水和自来水中却很难检出其存在,而南京市串城河污水中蛭弧菌的数量竟高达4980PFU/ml。1990年呼兰、刘秉阳报道自人体粪便中分离到蛭弧菌,但其量较低。蛭弧菌一年四季均可在外环境中存在,一般在气温较高的夏季较多。这些研究填补了我国的空白。我们分离的蛭弧菌在灭菌自来水中于4℃环境中可存活4~6个月,最长可存活18个月,用脱脂牛奶作保护剂,冻干于4℃冰箱中保存,其80%的菌株可存活3年以上。此外。我们还发现并证实上述3种方法保存的蛭弧菌培养物生物特性及对宿主菌的寄生性并不改变。这一研究结果已达到国际同类研究水平。实验研究中我们又发现蛭弧菌在加热和三氯甲烷(氯仿)致死的宿主菌中形成噬斑的时间可由48h以上缩短到14h。噬斑数目也高于在活菌宿主上形成有噬斑数目67~265倍,而在抗生素致死的宿主菌中却无此现象,与在活菌中没有差别。此类现象迄今未见国内外有任何报道。我们分离的蛭弧菌株对许多肠道致病菌,如霍乱弧菌、不凝集弧菌、伤寒沙门菌、副溶血弧菌、福氏志贺菌及大肠杆菌等均具有显著的裂解作用,例如蛭弧菌Bd81和Bd98对69株弧菌(包括典型霍乱弧菌、El TOr霍乱弧菌及不凝集弧菌)的裂解率分别为79.0%和81.2%;对206株伤寒沙门菌(包括标准菌株及江苏地方菌株)的裂解率分别为96.6%和99.02%。并发现蛭弧菌对霍乱弧菌、伤寒沙门菌株的裂解无噬菌体型、血清型及耐药型的选择。近年来,由于多种原因,国内许多肠道致病菌广泛地污染着水源、威胁着人群健康。尤其是El TOr霍乱弧菌引起的霍乱(属国际检疫传染病),自1961年以来一直不断地扩散和蔓延;由伤寒沙门菌引起的伤寒、副伤寒近年来在我国某些省、市、自治区发病率显著回升,我省1988年的发病率竟高达531.36/10万;另外,由副溶血弧菌引起的食物中毒以及广大农村“秋季腹泻病”的发病率也均呈显著升高。这些疾病的发生和流行严重危害着人体健康,危害着人类的生产和生活,国家每年要耗费大量的人力、物力和财力进行防治。研究这些疾病的防治对策,制止其流行和减少发病率是一个极其重要的研究课题。我们发现蛭弧菌在我国也存在,并分离出了该类菌株,以及对此类菌的生物学、生态学及噬菌特性进行了研究之后,又着手于蛭弧菌对El Tor霍乱弧菌、伤寒沙门菌及其他肠道致病菌等在自然河水中净化作用的研究。1981年卫生部卫防局字第105号文件批准列为“用生物学方法杀灭El Tor霍乱弧菌”的重点研究课题,1983年卫生部卫防局字第27号文件再度确认这项课题。1988年江苏省科学技术委员会合字88第(039)号文批准把这项课题列为江苏省社会发展与一般应用研究的重点项目。1985年我们利用蛭弧菌对实验条件和模拟自然条件河水中的El Tor霍乱弧菌、福氏志贺菌、大肠杆菌等净化作用进行研究并取得满意结果。初步发现蛭弧菌Bd81在实验条件或模拟自然条件的河水中,7d后对霍乱弧菌、福氏志贺菌、大肠杆菌的清除率可分别达到99.0%、92.8%、99.9%。1987年我们进一步研究蛭弧菌对自然河水中细菌的净化作用,结果证明蛭弧菌对自然河水中的不凝集弧菌、大肠菌群及细菌总数均有显著的净化作用,例如,15d以后,不凝集弧菌、大肠菌群及细菌总数含量能分别减少99.95%,99.90%,97.34%,经统计学处理,对照组与实验组有非常显著性差异(P<0.01)。这一结果迄今尚未见国外有同样报道。

蛭弧菌在自然河水中由于对革兰阴性菌的裂解范围更为广泛,也可看到对河水中革兰阴性菌与阳性菌比例的影响。另外,我们还发现蛭弧菌在自然河水中净化细菌的过程中,能利用宿主菌细胞维持自身的生命活动,并可以不断地生长繁殖。研究结果还表明,在水体中蛭弧菌与大肠杆菌、El Tor霍乱弧菌的比值为1:1000~1:10000时对水体中的细菌净化效果特别显著,蛭弧菌生长繁殖的数目也最多。

总之,本项研究所取得的主要成果可概括如下:(1)为我国建立了蛭弧菌的研究方法。其建立的蛭弧菌培养物的保存方法,为我国蛭弧菌的进一步研究和应用创造了条件。(2)其所发现的蛭弧菌在加热或氯仿致死的宿主中可迅速、更多地出现噬菌斑,经在死亡的宿主菌中增殖的蛭弧菌仍能感染活的宿主菌这一事实具有重要的理论和实践价值。(3)本研究发现并证实蛭弧菌对自然河水中细菌之净化作用,为利用蛭弧菌净化自然水体中的霍乱弧菌、伤寒沙门菌等肠道致病菌提供了重要的科学依据,而且具有极广泛的应用价值,从而为在预防和控制国内常见的此类肠道传染病方面,在净化自然水体及水源保护方面,将产生巨大的社会效益和经济效益。(4)蛭弧菌在河水中的存在及数量与水体污染程度呈正相关,而且对自然河水中革兰阴性菌的裂解效果优于对阳性菌的裂解效果,这一发现,为今后利用蛭弧菌作为评价水质卫生细菌学的指标提供了科学依据和实际应用的可能性。

七、国外对蛭弧菌的研概况

    1962年发现蛭弧菌以来,各国至今已发表论文500余篇,研究者对它的分类学、细胞学、免疫学、生理学、生物化学、分子生物学、生态学以及蛭弧菌与宿主菌的相互作用等进行了大量的工作。

   (一)蛭弧菌的基本特征

    蛭弧菌的基本特性,可概括为如下几点:(1)一般呈弧、杆状,有时呈螺旋状;(2)菌体狭小。宽约0.3~0.45μm;⑶端生鞭毛;很少多于1根,鞭毛带鞘,并着生于一端;⑷革兰染色呈阴性;⑸严格好气;⑹化能有机型;⑺含有DNA,并具有高度同源性,G+C含量为42%~51%;⑻明显而稳定地分解蛋白质;⑼通过TCA循环进行代谢;⑽一般不能分解利用碳水化合物,而利用肽、氨基酸作为碳源和能源;⑾具有双形性的发育史,有鞭毛交替,捕食性的类弧菌游动子(能用鞭毛尖端附着寄生细胞),无鞭毛螺旋状营养阶段(通常在寄生细胞内);⑿实际上能够进入到宿主细菌内,并在那里发育、繁殖或具有某种遗传力。其中寄生性和溶菌性是蛭弧菌一个重要的标志。尽管发现有腐生或兼性腐生现象,但它都由寄生蛭弧菌衍生而来,因此对大多数蛭弧菌来说均具有寄生或兼性寄生的性质,而腐生生活的仅占少数。

     (二)蛭弧菌的分类

     伯杰细菌鉴定手册已把蛭弧菌列入螺菌科位置不定的属——蛭弧菌属。有人认为蛭弧菌与动物寄生菌——弯曲杆菌属(Campylobacter)在形态和性质方面有某此相似之处,但按其DNA的G+C百分含量,以及寄生的生态特性两者有所不同。因此认为,弯曲杆菌与蛭弧菌在分类上没有亲缘关系。蛭弧菌与弧菌关系如何呢?尽管在形态上有某此相似,弧状。如梅氏弧菌、霍乱弧菌也有鞭毛,按其DNA碱基组来看,弧菌的G+C百分含量为40%~50%,略低于蛭弧菌,可是它的代谢特征为嫌气性或兼性嫌气性代谢,能利用葡萄糖,与蛭弧菌显然不同,基于这些特征差异,认为两者不能列为同一个属。

    Stolp等根据G+C百分含量,各种酶活性、耐药性、寄生性以及其他细菌学特性,把蛭弧菌分为3个种类。Bd.bacteriovorus的G+C百分含量比Bd.stolpiiBd.starrii都要高。就寄生性而言,Bd.bacteriovorus一般为专性寄生。但从其衍生的菌株,失去其寄生力而营专性腐生生活,Bd.stolpiiBd.starrii两者虽具有兼性寄生,但后者可寄生假单胞菌属菌株,其蛋白酶活性,耐药性又比Bd.bacteriovorusBd.stolpii都要高。

    近年来的人发现,除上面3种以外的一些新种,如Bd.chlorellovorus等,它们对藻类的弧状体裂解而逐渐死亡。

    有人还以蛭弧菌生活方式分类,把它们分成两个类型:⑴寄生型:没有寄生细胞或其提取物就不能生长繁殖,它必须从寄生细胞中获得所需的营养物质或生长因子,有人把这种寄生性关系称做寄生性共生关系;⑵非寄生型:不依赖于寄生细胞而营腐生生活,寄生蛭弧菌在蛋白胨和酵母提取物培养基上能生长繁殖,但它们几乎都丧失寄生性。而直接从自然界分离得到的非寄生型,至今尚没有见到报道。

   (三)蛭弧菌生理化特性

    蛭弧菌生长要求的pH为6.0~8.5。温度为20~37℃,12℃,42℃时则不生长。它能使明胶液化。在人工培养基上产生黄色色素、细胞色素a、b、c,还能产生各种酶类:如蛭弧菌HDBd6-5-S和蛇螺菌VHL菌株均产生胞外酶,诱导损伤寄生细胞溶解和消化,它和Bd100、Bd109、BdA312等在蛇螺菌VHL细胞悬液中也能产生蛋白酶,而HIBd培养物(腐生菌)亦具有产生蛋白酶能力,能消化骨胶原制剂。Bd6-5-S还能产生一种酯酶,促使细胞壁降解,并可利用寄生细胞质中的内含物。蛭弧菌还产生胞壁质酶,系一种蛋白质分解酶,HDBd6-5-S和蛇螺菌VHL混合培养时分离一种能降解来自蛇螺菌、未经纯化的粘肽,这些酶的产生与寄生菌侵入寄生细胞有关系,其后果使寄生细胞被消化。HDBd109的细胞含有胞壁酸和葡萄胺。还有13种氨其酸,这些物质同其它细菌胞壁成份相类似,从HIBd菌株中分离到核糖rRNA,Bd6-5-S在蛇螺菌中繁殖,则产生含有氨基糖和可溶性胞壁酸的亚显微粒子的释放。

    这些菌所需的能源不是从碳水化合物中获得,而是从生活的寄生细胞或杀死的寄生细胞中获得它所需要的一种或多种营养物质,但这种“生长因子”的营养物的性质及其精确的营养需要还不是很清楚。

     蛭弧菌HIBd的蛋白质含量较丰富,可达干重的60%-65%,DNA含量为5%,而DNA的合成是在寄主DNA完全裂解后发生的,然而寄主细胞DNA消失的详细情况尚不是很清楚。据报道有80%的寄主DNA并到寄生菌DNA中,在Bd.starriiA312和Bd109中发现dTMP、UMP、dCMP、核糖、腺嘌呤和鸟嘌呤,BdUKiz含有磷脂。这些物质在其生命中是不可缺少的组成部分。

     大多数细菌的rATP值(每消耗1mol ATP所得细胞干重的数量)大约为10,而蛭弧菌的rATP值则为20-30。Ritteuberg认为,达到这样高效果的部分原因是蛭弧菌具有直接从宿主细胞吸收核苷酸的能力,因而贮存了高能磷酸键。

    (四)蛭弧菌的生态学及在自然界中的作用

     蛭弧菌广泛存在于自然界,土壤、河水、近岸海水以及下水道的污水中都有它们的分布,可是干净的井水、矿泉水、自来水中都很难找到蛭弧菌的存在。一般污水中含量为105PFU/ml,土壤中含菌数为103-105PFU/g,淡水、海水中含菌量仅为50PFU/ml。据报道日本下水道污水中含蛭弧菌为每毫升数万个。然而它们在自然界究竟起什么作用呢?有人归纳为两个方面:⑴由于蛭弧菌具有寄生和溶菌能力,所以有可能利用这种拮抗作为同农业致病菌作为斗争的有力武器。有实验指出,将水生细胞和水稻白叶枯病菌加入灌溉水中,便成为蛭弧菌的“食料”,结果致病菌大大减少了。另外,蛭弧菌还对大豆疫病假单胞菌有较强的侵染力。⑵由于这类菌广泛存于污水中,它对污水中常见的大肠菌具有寄生性,同时对污水中的弧菌属、志贺菌属、沙门菌属的细菌消除亦起重要作用,因此有人把蛭弧菌作为河流水域污染程度的一项最好指标。另一方面,它在水源自净方面无疑也起着十分重要的作用。苏联Pushchino污水处理厂用蛭弧菌净化污水的研究已取得成果。

八、近10年蛭弧菌的研究方向及展望

      1962年以来,蛭弧菌的研究,尤其是蛭弧菌的生物化学、分子生物学及其蛭弧菌净化环境水体中致病菌等研究进展很快,但尚有许多问题还需要做进一步的研究;甚至是很艰苦的探索工作。近年来我国已有许多实验室相继开展了对这项工作。

   (一)利用蛭弧菌净化水源,控制或减少肠道传染病的发生和流行

     运用生物之间的相互拮抗作用,开展生物防治已受到人们的重视,并进行了广泛的研究。德国学者正在使用细菌除去水中硝酸盐的技术,他们发现脱氧副球菌通过一简单的工艺流程就能除去水里的硝酸盐,这种细菌能将硝酸盐变成无害的产物——氮。另外有人运用微生物清除生活饮水中氨的技术,以绿藻、硅藻等为主的6种微生物,可除掉生活饮用水中802%-90%的氨,50%以上的大肠杆菌。细菌也是灭蚊的新式武器,据研究报道,把苏云金杆菌和球形芽胞杆菌的培养物稀释几十万倍甚至百万倍仍然能有效地杀灭孑孓。

     蛭弧菌在生物防治中作用,近年来已引起人们极大的兴趣和关注。实验研究已证明,蛭弧菌对许多种属的细菌有清除作用。今后的研究方向,主要是如何将蛭弧菌推广应用于自然环境水体净化,以改善水源,保护环境,控制或减少疾病的发生,造福于人类。这项技术人们必须从以下两方面去研究它:⑴蛭弧菌在自然环境中与其它生物的关系,特别对自然水体中致病菌自净作用是个极其重要而具有意义的生物学和生态学问题,值得很好的探究。⑵高产量蛭弧菌株的选择以及生物制剂的生产,目前实验用蛭弧菌显然不宜作为生物制剂生产用菌株;而且蛭弧菌的增殖需大量的宿主菌的营养来源,所以蛭弧菌生物制剂的生产工艺不同于一般生物(细菌)制剂的生产。

     目前已有人成功地从人类粪便中分离到蛭弧菌,这一研究成果,为利用蛭弧菌预防肠道传染病提供了极为重要的依据,推测口服蛭弧菌肠溶制剂可能对肠道致病菌是有预防作用的。但蛭弧菌也将会使人肠道正常菌群遭到破坏。这一新的矛盾必须加以研究解决。

     蛭弧菌用于动物(兔、豚鼠)角(结)膜炎的防治已获得成功。而且蛭弧菌以10亿个菌的剂量以小鼠、家兔等不存在毒性作用,就是用于猴肾、HeLa细胞组织培养亦不引起任何细胞病变。因此,有人推测可否将蛭弧菌用于某些耐药菌株的杀灭,对部分外科、烧伤感染患者的局部治疗或许是有益的。

    (二)蛭弧菌分子遗传学的研究

     目前,遗传工程已成为生物科学中的一门最引人瞩目的学科,1978年美国分子生物学家借助于人工合成的限制性内切酶,从大肠杆菌的染色体上剪去一段DNA,然后把能合成人胰岛素的基因,以质体为运载工具移接到大肠杆菌的染色上,细菌在恢复生长后,便具有合成人工胰岛素的能力。蛭弧菌噬菌体-蛭弧菌-蛭弧菌宿主菌系统是引人注意的独特的“三位一体”的寄生体系,蛭弧菌噬菌体感染蛭弧菌,并在蛭弧菌体内复制子代噬菌体,蛭弧菌被蛭弧菌噬菌体感染后可继续感染宿主菌,并可利用宿主菌DNA合成蛭弧菌子代,这已经被研究证明。如能从某一致病菌的染色体上切去一段DNA,移接一段蛭弧菌基因到致病菌的染色上去,使致病菌丧失致病力而仍保持抗原特性,然后再用该菌株生产菌苗或用于其他生物学的研究,可能是有前途的。

     进一步研究蛭弧菌在生物防治中的作用是专家们近年来一致呼吁的。蛭弧菌对宿主特异性不强,工、农、医微生物都有被“寄生”和“裂解”的可能。因此,蛭弧菌不仅限于医学微生物的防治,国外70年代就有人用蛭弧菌防治植物病菌,如水稻白叶枯病菌,白菜软腐病菌等。近年来有人试图用蛭弧菌预防家禽、家畜的肠道传染病,如“鸡白痢”等。我们曾对蛭弧菌用于预防水生物病原菌净化作用进行过研究,并取得满意结果。目前,我们正致力于蛭弧菌预防人体肠道传染病和鱼、虾等水产品细菌性疾病的研究。因此,我们研究蛭弧菌,应扩大其研究范围。推测用蛭弧菌对工、农业微生物的生物防治以及环境保护,其前景是诱人的,将会产生较大的社会效益和经济效益。

本文发表于中国科学技术出版社出版的《医学分子微生物学进展》第二集第104-119页

 

参考文献

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